（「CE-TOFMSって何？」って方は①から読んで下さいね）

今日は、④のような方法の大局ではなく、極めて細かい条件の検討です。

私がもう一点こだわったことは、大腸内容物（ウンコになる直前の大腸内にあるプレウンコ）から代謝産物の抽出条件です。
健康に影響する腸内常在菌の代謝産物（産生物）は、菌体外に放出される物質でなくてはならず、菌体内の代謝産物は除かなくてはなりません。

しかし、これまで、CE-TOFMSメタボロームで分析されてきた実績のある研究対象は菌体内や細胞内の代謝産物で、菌体外のものは対象外でした。
菌体内の代謝産物を調べるには、菌体を破壊して内容物を得る必要がありますので、
前処理は有機溶媒（アセトニトリルやメタノール）で抽出していました。
確立されていましたが、今回と目的と正反対なので使えません。

従って、抽出法に関しては一から検討しました。

ウンコを何度も何度も使って...。
ウンコをある条件で抽出しては、菌体が破壊されて、菌体内の遺伝子が抽出液中に出ていないのかのチェックを繰り返しました。
また、菌体が破壊されない条件でも、菌体外成分の抽出が不十分だと意味がありません。
CE-TOFMSは電圧をかけ分析するので、それに影響が出る塩類も大敵でした。
苦労しましたが、なんとか菌体を破壊せず、ウンコ中の菌体外代謝産物をきっちり抽出し、CE-TOFMSの分析にも影響しない条件を見出したのは半年後のことでした。

論文審査の中で審査員に突っ込まれましたので、そのデータはSupplementary Information（付属データ）の9番目の図にあります。

ウンコ抽出方法の検討というマニアックな中身ですが、興味のある方は、論文の下の方のSupplementary Informationのファイルをダウンロードして頂ければ検討した内容を見ることができます。

「そんな細かい点にまでこだわって実験してたんだ！」
と思って頂ければ幸いです。

つづく

もう一度①から読んでもらえれば、今日もわかり易いと思います。

代謝産物を網羅的に調べる研究には特別な名前が付いておりまして"メタボロミクス"と言います。
代謝産物は英語でメタボライト（metabolite）、網羅的に分析する学問はオミクス（omics）という接尾語を付けますので、あわせてメタボロミクス（metabolomics）というわけです。

昨日まで書いてきたように、CE-TOFMSでメタボロミクスを行えば、腸内常在菌の代謝産物の全貌が解明できそうな予測が立つと、如何に文句のつけようのない試料を準備できるかということが重要になってきます。
そこで実験方法は慎重に考えました。

一つ目は細かい手法ではなく、実験系全体の構想です。
明確に腸内常在菌の影響を調べるためには、一切菌が付着していない無菌マウスというものを使うのがベストだと考えました。
しかし、単純に同じ系統の無菌マウスと普通に菌が棲んでいるマウス（通常菌叢マウス）を用意して比較したら突っ込みどころ満載です。

大腸では代謝産物の吸収もあるでしょうから、生体側の条件を極力揃えました。
つまり、同時に生まれた兄弟を2つに分けて遺伝的差異を小さくしました。
マウスは大体8－12匹の子供を一度に産むので、オスだけ選び（6匹）、それをしばらく無菌的に飼育しておきます。
そして生後4週目に、2つのグループに分けて、片方（3匹）はそのまま、もう一方（3匹）は通常菌叢マウスの糞便懸濁液を経口投与し、通常菌叢マウスを作りました。
そして同じ条件で育てて、生後7週目に大腸内容物を回収したのです。

また、1度だけの実験ですと再現性（同じことをやると同じ結果が得られるのか？）という点で文句がつく可能性がありますので、
同じ父親と先の母親の妹マウスとの間で子供を産ませて、
全く同じ実験を繰り返しました。
これ位の計画を立てておけば、実験系として突っ込まれる可能性は低くなります。

つづく

腸内常在菌がどんな成分（代謝産物）を大腸の中で産生しているのか？
実は私が盛んにアピールしているポリアミンもその一つです。
しかし、ヒト1個体当たり平均160種類程度の腸内常在菌が棲息している訳ですから、
他にも色々と作っているはずです。

腸内常在菌の代謝産物を調べるには、ウンコからそれらを抽出し、高度な分析機器で分析する必要があります。
最も使われているのが高速液体クロマトグラフィー（HPLC）といわれるものです。
ポリアミンもこれで測定しています。
他にも、現時点で研究が進んでいる酪酸などもこれを使って測定します。
しかし、ターゲットとする成分により、様々な分析条件（抽出、前処理も含めて）を変えなくてはならず、一度に網羅的に調べることは極めて困難です。
ポリアミンと酪酸を同時に調べることすらできません。

しかし、技術の進歩は凄いですね。
新たな分析技術が現れたのです。
慶応義塾大学先端生命科学研究所の曽我教授が開発された技術、
その名は、"キャピラリー電気泳動－飛行時間型質量分析計"
略してCE－TOFMS（英語で書いた場合の頭文字です）！

はい、訳わからんのは十分に承知しております。
ですが、これが名前なのでどうすることもできません。

代謝産物の多く（例えばアミノ酸など）は電荷を持っており、電圧をかけると自分の持つ電荷と反対の電極へ移動する（プラスのものはマイナス極へ）ので、その性質を利用して成分を分離する（一つ一つに分ける）のです。
これがキャピラリー電気泳動の仕事です。
そして、分かれた成分を飛行時間型質量分析計で何という物質なのかを決定するのです。

つまり、電荷を持つ物質ほぼ全てが一度の分析で調べられるのです。
そして、生物が作る代謝産物の大部分は電荷を持っているのです。

この方法を使えば、世界中の誰もやったことが無い腸内常在菌の代謝産物の研究ができると確信を持った私は、自慢の"少々強引な交渉力"を発揮して、予算内で研究を開始したのでした。

「少々じゃないでしょう。無茶苦茶強引でしょう」
という声が聞こえそうですが...。

今では、腸内常在菌が健康に密接に関連していることは一般の方々も知っています。

大半の方の腸内常在菌に関する理解は、
「ビフィズス菌のような善玉菌は体に良いことをして、反対に悪玉菌は悪いことをしているので、善玉菌を増やせば良い」というものをベースにしたものだと思います。

研究分野でもこの考え方がベースにあり、これまで何十年間も、腸内常在菌の菌種構成を調べる研究が中心に行われてきました。すなわち、

どの菌が善玉菌なのか？　あるいは悪玉菌なのか？
病気あるいは健常なヒトにはどんな菌種が棲息しているのか？
というアプローチです。

でも、今の所、「腸内常在菌は1000種類以上存在し、一人当たりは160種程度で構成されており、個体により棲息菌種が大きく異なり、個体差が極めて大きい」という程度のことしか自信を持って言えません。少なくとも私は（10年以上菌種構成を調べる研究を頑張ってやってきたのですがね...）。

さて、質問です。
どのように腸内常在菌は健康に関与しているのでしょう？
そもそも善玉菌や悪玉菌は、腸内で何をしているのでしょう？
たぶん、これに明確に回答できる研究者はいないでしょう。

私は、彼らが大腸内で作る産生物（専門的には細菌の代謝によって産生される物質なので「代謝産物」と言います）が健康に強く影響していると信じています。

理由は簡単。
分子量が小さく（サイズが小さい）、大腸の粘液に浸透でき、大腸の細胞に直接的に作用すると同時に、血液中にも吸収され全身を巡ります。

良く考えて下さい。悪玉菌がいるだけでは何も起こりませんが、悪玉菌が有害物質を産生することで、それが細胞を傷つけてガン化が起こったり、炎症が生じたりするのです。

しかし、腸内常在菌の代謝産物に関しては全く研究が進んでいません。
注目されている代謝産物は、ほんの10種類程度ではないでしょうか？

そもそも、どんな代謝産物が存在するのかすら知られていません。
調べたい、調べたい、調べたいー。
昨日も述べた知的好奇心というやつですね。

つづく

先日、Scientific Reportsに掲載された論文を何回かに分けてその解説をしたいと思います。

この論文、基礎的な研究のレポートでして、本来は大学等の公の研究者が行う仕事です。
皆さん、普通は応用研究を行う企業研究者が、
しかも協同乳業のように小さな会社の研究員が、
何故このような基礎研究の論文を発表しているのか不思議に思うことでしょう。
著者の私もそう思っているので、当然です。

念のために説明しますが、基礎研究とはウィキペディアにはこのように書いてあります。
「純粋研究とも呼ばれ、理論や知識の進展を目的にしている。
その出発点は知的好奇心であり、
研究成果を何かの役に立てることが目指されているわけではない。」

これに対し、応用研究とは、下のように書いてあります。
「具体的な問題の解決を目指すことが出発点であり、
産業や社会の発展のために行われる。」

すなわち、昨年8月に発表し多くのマスコミに取り上げられた
「ビフィズス菌LKM512でマウスの寿命伸長効果が得られた」というような、
企業の商品価値の向上に直接的に繋がる研究成果は応用研究であり、
今回の基礎研究的な論文とは性質が異なります。

「なんで俺がやったんや？」
簡単にいうと、別の目的でこの実験にトライしたのですが、
びっくりする結果が出たので論文にまとめたということです。
但し、完全に予想外の偶発的な成果であった訳ではありません。
ウィキペディアに書いてある通り、
強い知的好奇心による裏テーマとして心の中で設定していました。
すなわち、
「この方法で調べれば、腸内常在菌の産生物に関する
これまでの知見を塗り替えるような新発見ができるかもしれない！」
というものです。

ということで、ややこしい内容ですが、
明日から簡単に説明できる範囲で解説したいと思います。

先日、Scientific Reportsに掲載された論文の解説をしようと、
昨晩、休日ですが頑張って少し書き始めたのですが、
その原稿を持ってくるのを忘れてしまいました。

先のブログで少し紹介したこれですね↓
http://lkm512-blog.com/2012/01/26/
腸内常在菌が産生する代謝産物を網羅的に調べた研究成果です。

困りました...　(→.←) ん～.....

では、仕方ないのでちょっと自慢を。

どうやらこの論文、結構研究者の方は興味を持ってくれているようで、
公開されて僅か1週間（2012年2月1日）の時点で、総ダウンロード数が歴代3位になっていました。赤丸で囲んだところです。

更に、e-mailで紹介された数は歴代1位になっていました。
（これは何の数値が正確にはよくわかりません。面倒なので調べる気もしません。）

Scientific Reportsはネイチャー姉妹誌では最も新しいジャーナルのため、
まだ250報弱しか論文は掲載されていないので、それ程凄いこととは思えませんが、
それでも、それなりの論文が日々掲載される中で、これだけ上位に来るのはうれしいですね。
それに、これは会員でなくても世界中の誰でもダウンロードできるジャーナルです。
幅広い研究者の興味を惹いた点は喜ばしいことです。

終わりました。
恐怖の1週間が。

記憶があまりありません。

確か月曜日は雪が降った日ですよね？

火曜日は在宅勤務で、たぶん20時間以上報告書を作成していたと思います。

水曜日は...、報告書の締切日としか記憶がありませんね。
そういえば、Scientific Reportsの公開時間が
予定（連絡を受けていた時間）より8時間ほど早く、大慌てで対処したような...。

木曜日は早朝から学会スライド作りで、何とか間に合わせ、
夜は懇親会で遅くまで飲み食いしました。

金曜日は、学会後、市民講座の準備しました。
たしか夜中の2時位まで。

土曜日は大宮ソニックシティーで市民講座。
舞台裏で、「一発目は何で笑わそうかな」と本気で悩みながら、
自分の出番を待っていた記憶だけが鮮明です。
結局ネタはまとまらず、ふわっとした感覚でスタートして、
エンジン全開まで5分間位かかったような気がします。

この1週間は、1ヶ月程前の出来事のように感じます。
そして、自分のこととしてではなく第三者的な視点でしか記憶していないのが不思議です。

怒涛の激走による副産物としては、
野菜の管理を怠った点と、目の下にクマができて残っている点が挙げられます。

ウンコ回数は排便の度にきっちりメモしており、
この記憶の曖昧さでデータが狂っていることはありませんので、ご安心下さい。
（誰も心配してないやろうけど、ウンコネタに触れないと気が済まないので書く。）
ちなみに大宮ソニックシティーでも、きっちりマーキングしました。

最後になりましたが、市民講座に来て下さった皆様、誠にありがとうございました。m(μ_μ)m

皆様お楽しみの、私の2011年ウンコ回数を発表する日が来ました。

と、その前に

「いよいよ大詰め、年間ウンコ回数 2011」のブログで、

2011年は12月26日時点で、目標の512回が
達成できそうなペースであったことを思い出して下さい。

熱心なこのブログの読者の方は、毎年、1月後半に発表することもご存知のようで、
「そろそろ、発表の頃ですね」
と言われたり、つぶやかれたりしています。

元日にはわかっていることなので、さっさと発表したいのですが、
1月は大相撲初場所がありますので、
ブログのネタは豊富で後回しになるのです。

では、発表します。
ジャ―――――――――ン、パンパカパーーン
私の2011年のウンコ回数は

508回でした。
良いペースだったんですがね、残念　(┬_┬)
ウィルス性腸炎のダメージが予想以上に残っていました。
抗生物質を2週間飲んだので、腸内菌叢がボロボロになっていたようで、何か調子が悪く、
とにかくウンコがいつものように出なかったんです。

12月後半は食べる量も普段と同じに戻っていたのに、出なかったのです。
結局最後の1週間は1日1回程度のペースで目標に4回足りませんでした。

2009年　509回
2010年　533回
2011年　508回

んー、こうやって並べてみると、謎の充実感！
3年もやると、おおよその私の年間ウンコ回数が把握できてきました。

英国ネイチャー（Nature）の姉妹誌、Scientific Reportsに

私の書いた論文が公開されました。

Impact of Intestinal Microbiota on Intestinal Luminal Metabolome
というタイトルです。
意訳すると
「腸内常在菌の産生する代謝産物の全容解明」
って感じですかね。

後日解説致しますが、
腸内常在菌が作る物質が健康に関与しているのは皆さん頭では理解しているのですが、
実際は、何が作られているのかすらわかっていなかったのが現状です。

じゃー、徹底的に調べてみよう！

ということでウンコ（大腸内容物）を徹底的に調べた研究です。
徹底的というのは徹底的です。
CE-TOFMSという高性能機械を使って、180種類近くの成分を検出したのですから！
└(^へ^)┘

腸内環境研究の世界では間違いなくインパクトがある内容です。
それ以外の医学、薬学、免疫学、細菌学、栄養学など、
あらゆる分野の方にも影響する内容だと思います。

このジャーナルは無料でアクセスできますので、是非読んでみて下さい。
http://www.nature.com/srep/2012/120125/srep00233/full/srep00233.html

日本語でないと困る方は、プレスリリースを出しておりますので、まずはこちらを参照下さい。
http://www.lkm512.com/contents/Scientific_Reports.pdf

私にとっては初めてのネイチャーグループへの論文掲載です。
うれしいですね　^～^

（実際は受理されて1ヶ月が経っておりますので、もう喜びも冷めておりますが。）

あっ、この内容も少しは話しますので、今週末の公開市民講座には是非来て下さいね！⇒ http://lkm512-blog.com/news/2012/01/128.html

「予想通りに死にかけています」に書いたことが、現在どんな状況か報告致します。

と、その前に。
今朝は車が会社に置いてあったので電車で出社したのですが、
案の定、途中激しい便意をもよおしました。
凍てつく公園の公衆便所に何とか辿り着き用を足しましたが、
私のプリ尻が凍りそうでした。
しかも、水も凍結しており・・・。
ここから先は秘密です。

さて、本題です。

本日1月25日の午前9時現在の状況です。
生研センター委託研究の報告書の締切（締切：本日5時頃）：完成度：95％
日本ポリアミン学会で発表（26日午後）：完成度：0％
公開市民講座で講演（28日）：完成度：0％，開催は他スタッフで準備順調）
プレスリリース（今日か明日か...）（完成度：98％）。

もう、この3日間は数時間しか寝ていない状況です。

とにかくメインの生研センターの委託研究の報告書の残り5％を仕上げないといけません。
5％といってもA4に50ページほど壮大なレポートなので、結構あるのですね。
1,000円の5％が50円でも、100万円の5％は5万円のように。

とはいえ、午後5時には必ず提出しますので、それ以降は1週間ぶりにほっと一息ですが...。

でも、明日の学会発表の準備があるので油断してはいけません。

そうです、なんとか便所に辿り着いても、水が凍っていて...、なんてことがありますので。